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片形吸虫种类鉴定的分子生物学研究进展

时间:2015-01-14 17:30:39  来源:  作者:沈永林; 胥全彬; 张洪英

片形吸虫隶属于片形科(FasciolidaeRailliet,1895)的片形属(FasciolaLinnaeus,1758)。据Yamaguti(1972)m分类记载,该属有6个种,其中寄生在家畜和人体的主要是肝片吸虫(Fasciola hepatica Linneuus,1758)和大片吸虫(Fasciola gigantica Cobbold,1855)。两虫不仅危害大,而且形态极相似,故对其分类和鉴别的报道也较多。同时,研究肝片形吸虫和大片形吸虫的分类鉴别,有利于加深对寄生虫进化过程中的分子变异、宿主和寄生虫关系的理解,也可为片形吸虫的流行病学调查、疾病防治、疫苗研制提供有用的信息。传统的分类学以形态为主,结合片形吸虫的生活史、流行病学等特征对虫体进行鉴别分类,比较全面准确、经济易行,具有现代许多分子生物学亚洲在线不可取代的优越性,但对片形吸虫亲缘种及可能的隐藏种的识别,还有很大的难度。随着细胞分子生物学的发展,其在寄生虫鉴别分类上的应用越来越受到重视,传统方法不能解决的问题正不断得以解决。现将这两方面的进展综述如下。

1 片形吸虫蛋白质多态性 Kimura 的中性理论为许多蛋白质分类亚洲在线应用于寄生虫的分类鉴别上提供了理论基础,这些亚洲在线主要包括同工酶分析和各种蛋白质电泳亚洲在线。同工酶是生物体遗传物质的表达产物,其变异能够体现生物体的遗传变异,因而在研究寄生虫种间分类和种内鉴别方面具有明显的作用。 Agatsuma等对6株日本孤雌生殖三倍体片形吸虫、14株韩国孤雌生殖二倍体片形吸虫、7株来自美国的典型肝片形吸虫、30株澳大利亚的肝片形吸虫的12种同工酶进行了淀粉琼脂糖凝胶电泳,所有虫体仅AK、Got、Gpi、6-pg和pgm-2有差异,根据同工酶谱日本片形吸虫可分为三型,而按形态,日本片形吸虫也能分为三型,这种对应关系说明日本片形吸虫可能存在独立进化。比较不同地区片形吸虫的同工酶谱,韩国片形吸虫与日本片形吸虫相似,而美国肝片形吸虫与澳大利亚肝片形吸虫相似。 除了同工酶,人们还以虫体的可溶蛋白及代谢分泌产物对片形吸虫进行分类鉴别。Lee等作了一系列工作。最初对来自绵羊和白尾鹿的肝片形吸虫的可溶蛋白及代谢分泌产物(ESP)进行等电聚焦电泳(1EF),发现两虫的可溶蛋白谱带存在差异:在pH 3.5~9.6间,两虫均有30个洗脱峰,除有三个峰重叠外,其余峰均不同,且大片形吸虫的洗脱峰多于肝片形吸虫。在相同pH范围内,ESP有23个洗脱峰,只有2个洗脱峰重叠,大片形吸虫的ESP洗脱峰也多于肝片形吸虫。这表明,用等电聚焦电泳能够区分出不同的片形吸虫,但由于试验中肝片形吸虫和大片形吸虫来自不同的宿主,因此上述差异是否受宿主种类的影响,以及影响有多大,尚难估计。为此该小组又对不同宿主的肝片形吸虫的可溶蛋白和ESP进行了研究,发现寄生在美洲驼、小鼠、大鼠的肝片形吸虫的可溶蛋白洗脱峰非常相似,而寄生在牛犊中的肝片形吸虫的洗脱峰则明显不同于前三者,除共有30个洗脱峰外,还多出三个洗脱峰。在ESP洗脱曲线上,在各虫的23个洗脱峰中,仅有三个洗脱峰重叠,美洲驼、小鼠、大鼠的肝片形吸虫比犊牛中的肝片形吸虫多一条重叠峰,说明不同宿主对片形吸虫ESP的影响更大。这种影响不仅提示在应用IEF区分片形吸虫时必须考虑宿主因素,而且也为深入理解宿主和寄生虫关系提供了材料。此外,这种影响是否会导致免疫机理的改变也值得进一步探讨。为了避免宿主因素对片形吸虫存在的影响,及IEF在片形吸虫分类鉴别上的适用性,Lee等又对寄生在犊牛体内的肝片形吸虫和大片形吸虫进行了可溶蛋白等电聚焦电泳,结果两虫洗脱曲线非常相似,大多数洗脱峰重叠,但肝片形吸虫出现1条特有的洗脱主峰,大片形吸虫中有特异的3条洗脱峰,这表明使用IEF检测片形吸虫的可溶性虫体蛋白能够区分开大片形吸虫和肝片形吸虫。

2 片形吸虫染色体核型分析 由于片形吸虫的可溶蛋白及代谢分泌产物受宿主影响较大,而其核型则保持相对稳定。因此,不少学者试图分析染色体核型来区分鉴别片形吸虫。Spakulovan等,研究西伯利亚肝片形吸虫的染色体核型,其染色体组成为2n=20。Moriyama等报道了日本片形吸虫的三种核型,即二倍体型、三倍体型及二倍体与三倍体镶嵌型。日本学者坂口佑二曾将本国片形吸虫与其他国家的片形吸虫进行核型比较,认为日本片形吸虫与韩国肝片形吸虫的染色体核型相似,而与澳大利亚、美国、泰国、印度、巴基斯坦、波多黎各等国的肝片形吸虫不同,后者染色体组成均为2n=20。 李国清等(1987)研究了中国甘肃的肝片形吸虫,发现其染色体组成为3n=30,其核型与日本片形吸虫相似,而与欧美等国则有较大不同,此结论与坂口佑二一致。1987年李杰华报道中国肝片形吸虫存在二倍体型及其同源三倍体型。尹怀志对中国福州片形吸虫的核型进行研究,结果证实了前者的结论,并发现了片形吸虫单价染色体与双价染色体共存于一个中期相,但不同于二倍体与三倍体镶嵌型。将片形吸虫核型与成虫的形态结合分析,认为中国的二倍体片形吸虫与大片形吸虫相似,而三倍体与肝片形吸虫相似,这与李国清等的研究基本一致,但与李杰华结果不尽一致。这些研究表明地理因素对片形吸虫的核型存在较大影响。鉴于国内结论的不一致以及日本三倍体片形吸虫有肝片形吸虫和大片形吸虫之说,染色体核型是否能用于片形吸虫的区分鉴别尚需持谨慎态度。

3 片形吸虫特定基因多态性 真核生物的rDNA是一种中度重复并具转录活性基因家族,其基本结构从核酸5,到3,依次为基因间隔区(nontranscribedspacer,NTS)、外转录间隔区(external transcribed space,ETS)、18SrRNA基因、内转录间隔区(internal transcribed space,ITSl)、5.8S rRNA基因,ITS2、以及28S rRNA基因等。rDNA的18,5.8,28SRNA编码序列区高度保守,而NTS及ITS则高度变异,故rDNA在寄生虫种间种内遗传变异分析及分类上广为应用。Walker等D4]研究曼氏血吸虫的rDNA时,发现用限制性内切酶BamHI能将此长为10kb的rDNA切成三个片段,将这些片段标记成探针psm889、psm389和psm890,对其他血吸虫间的种内变异进行检测,取得较好结果。Blair等.(1989)对来自澳大利亚、新西兰、墨西哥、匈牙利、西班牙的肝片形吸虫,来自马来西亚和印度尼西亚的的大片形吸虫和日本片形吸虫的rDNA在9种限制酶酶切、电泳、Southern印迹后,应用上述探针进行杂交,得到各虫的rDNA限制酶切图谱,发现肝片形吸虫rDNA上有IB个酶切位点,大片形吸虫有17个酶切位点,其中肝片形吸虫rDNA上有2个Hind III特异酶切位点,2个Xho及1个KpnI特异酶切位点,大片形吸虫上有kpnI和PstI两特异酶切位点,日本片形吸虫与大片形吸虫的酶切图谱一致。因此利用rDNA的酶切图谱便可将大片形吸虫和肝片形吸虫区分开,日本片形吸虫可能为大片形吸虫。虽然此法需要较多探针和限制酶、费用高,但却给片形吸虫的鉴别分类开辟了新途径。 rDNA的两个间隔序列ITSl,ITS2以中性突变形式进化,因而在近缘种的区分鉴别上非常有用。针对Blair等的研究没有在间隔序列发现有鉴别意义的酶切位点,Robert等对来自澳大利亚、匈牙利、墨西哥、新西兰的肝片形吸虫,美国的拟大片形吸虫(Fascioloides magnaBassi,1875),印度尼西亚和马来西亚的大片形吸虫,以及日本的片形吸虫的ITS2进行了测序,结果表明各片形吸虫种内的变异差异极小,而种间则存在较大的差异;肝片形吸虫与大片形吸虫及拟大片形吸虫种间分别存在2.8%和13.2%的差异;日本片形吸虫与大片形吸虫ITS2序列相同,这说明日本形吸虫可能是大片形吸虫,这个结论与Blair等的结论基本一致。ITS2在种间的较大差异,表明它完全可以用来区分不同种片形吸虫。但由于试验中日本片形吸虫数量少,且缺乏倍性描述,故还不能对日本片形吸虫的分类地位作出最终结论。 Itagaki等从线粒体的细胞色素C氧化酶亚基I基因(C01)和NADH脱氢酶亚基I基因(NDl)的角度对片形吸虫的鉴别分类进行了研究。有事实表明线粒体的NDI序列和COI基因在种群间存在遗传变异,可用于近缘种的分类(Despresetal l981,Bowleseta1 1992)。鉴于以往的研究都没有考虑日本片形吸虫的倍性,他们对所研究的日本片形吸虫的倍性进行了确认。通过对3株日本三倍体片形吸虫、3株乌拉圭肝片形吸虫、3株赞比亚大片形吸虫的NDI和COI基因进行序列分析,发现各虫的COI及NDI基因在种内差异极小(≤0.02%),而在种间则有较大差异;肝片形吸虫与大片形吸虫的COl及NDl种间差异分别为1.4%和 0.6%~L1%;日本片形吸虫与大片形吸虫的两基因的序列完全一致。因此,这些日本片形吸虫被认为是大片形吸虫。此外,还发现l株大片形吸虫与另外2株在 COI基因上无差异,但在NDI序列却有8.3%变异,这表明该株大片形吸虫有可能是一隐蔽种。这个实验表明片形吸虫的COI及NDl种间存在较大差异,不仅可以用来鉴别片形吸虫,而且对近缘种的发现也有一定的价值。 Itagaki等又结合核型及ITS2对日本三倍体片形吸虫与肝片形吸虫和大片形吸虫间亲缘关系和分类地位作了进一步研究,实验对7株日本三倍体片形吸虫,2株乌拉圭肝片形吸虫,4株来自赞比亚和印度尼西亚的大片形吸虫的ITS2进行测序,结果发现日本三倍体片形吸虫明显分为两型:7株中有6株日本三倍体片形吸虫与乌拉圭肝片形吸虫ITS2系列一样,另一株日本三倍体片形吸虫则与印度尼西亚的大片形吸虫一样。这个结果表明,日本的三倍体片形吸虫不能全都归结为大片形吸虫或肝片形吸虫。结合NDI和COI基因变异资料,研究者认为日本的三倍体片形吸虫有可能是肝片形吸虫发生杂交并在进化过程中产生分歧,形成类似大片形吸虫和肝片形吸虫的两类日本三倍体片形吸虫。这个假说可以从根本上解释日本片形吸虫的亲缘关系,同时也对核型分析在片形吸虫区分鉴别的意义提出了质疑。

4 片形吸虫基因组DNA多态性 限制片段长度多态性(Restriction fragment length Polymorphism,RFLP)是发展最早的分子标记之一,它的出现促进了分类学的发展,其基本原理是利用限制酶酶切不同的个体基因组DNA后,Southern杂交,从而显示出与探针同源的酶切片段在长度上的差异,RFLP标记呈盂德尔遗传,不受环境影响,是一种共显性标记,可区分纯合基因型和杂合基因型,结果稳定可靠,重复性好,是分析种群间遗传变异及分类的好方法。徐恒等。"首次采用此亚洲在线对来自黄牛、水牛和牦牛的肝片形吸虫进行了分析。限制酶酶切结果显示,只有BamHI和EcoRI能够在牦牛肝片形吸虫与水牛片形吸虫、黄牛肝片形吸虫之间产生特异性限制酶切片段,牦牛肝片形吸虫与水牛、黄牛肝片形吸虫之间的遗传距离为0.023,杂交后,BamHI酶解的牦牛肝片形吸虫DNA增加了一条分子量约为170bp的条带,EcoRI酶解的牦牛肝片形吸虫增加了一条约0.7kb的带。使牦牛肝片形吸虫与其与黄牛、水牛片形吸虫的差异更为明显,结合抗原差异比较分析,认为这种差异是由地理隔离及宿主因素引起的。另外,牦牛肝片形吸虫也可能与水牛、黄牛肝片形吸虫是不同种(后两者间无限制性片段长度差异),因此这种差异是种间差异还是种内差异,尚不明了,但无疑会促进从基因组水平去寻找肝片形吸虫与大片形吸虫DNA标记序列工作的开展。 随机扩增多态性DNA亚洲在线(random amplified polymorphicDNA,RAPD)是一种建立在PCR基础上的DNA多态性检出亚洲在线,它通过一系列寡核苷酸引物(通常为10bp)对总DNA进行扩增,扩增结果因总DNA的序列变异而呈现多态性,这种多态对于寄生虫亲缘种的区分十分有用。RAPD因其多态性高;能检出种间乃至种内个体间的变异,在国内外已有较多的应用如后圆线虫、棘口吸虫、艾美尔球虫、蜱等分类学中。还未见有对片形吸虫应用的报告。胥全彬等为区别南京市江宁县采集的水牛片形吸虫非典型形态虫体,首次应用RAPD亚洲在线,对国内外6株片形吸虫总DNA进行扩增,电泳图谱经聚类分析表明江宁县片形吸虫既有形态典型的肝片形吸虫,也有形态不典型的大片形吸虫。6株中,大片形吸虫种内差异为0.255。肝片形吸虫种内差异为0.106~0.255。肝片形吸虫与大片形吸虫种间差异为0.426~0.553,认为RAPD亚洲在线能较好地鉴别传统方法难以区分的非典型形态片形吸虫。

5 结语

片形吸虫的种类鉴定从传统的形态学分类到现在的分子生物学分类,分析手段越来越复杂,认识越来越深入。从方法论来讲,目前所用的分子生物学手段如RFLP、ITS2测序、rDNA酶切图谱比较等都不同程度地存在操作繁难、费用高昂、费时费力等缺陷,使这些分类鉴别方法难以在实际运用中加以推广。RAPD亚洲在线具有简单易行、多态水平高、可在对研究对象遗传背景毫无了解的情况下进行遗传分类研究等优点,适合寄生虫近缘种的鉴别及新种的发现。从前述看出,片形吸虫分类认识上已取得了一些成绩,亦还存在着亟待研究的问题,如关于日本三倍体片形吸虫的分类已有一些令人信服的证据,但要最终得到证明,还需从片形吸虫的发育进化方面进一步研究;中国、日本、韩国等东亚国家片形吸虫的核型基本一致,但对于中国片形吸虫核型的研究尤其是大片形吸虫核型研究还很少;我国有关二倍体与三倍体的片形吸虫至今还未有足够的资料加以证实;在大片形吸虫与肝片形吸虫的区分上,国外早已深入到DNA水平,但我国在这方面的研究还刚刚起步。研究的滞后在一定程度上阻碍了对片形吸虫免疫研究等诸多方面的发展。

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